คู่มือแลปแอมโมเนีย NH3-N

0ภาพรวมและหลักการ

อ่านหัวข้อนี้ก่อนลงมือ จะได้รู้ว่าแต่ละขั้นตอนทำไปเพื่ออะไร

หลักการ: Berthelot reaction

NH₃-N ไม่มีสี จึงวัดค่า absorbance ตรง ๆ ไม่ได้ ต้องทำให้มันเกิดสีก่อน โดยให้ NH₃-N ทำปฏิกิริยากับ Alkaline hypochlorite และ Phenol โดยมี Sodium nitroprusside เป็นตัวเร่งปฏิกิริยา (catalyst) จะได้สาร Indophenol สีน้ำเงิน แล้ววัดค่า absorbance ที่ 630 nm

NH₃ + hypochlorite + phenol (nitroprusside) → Indophenol ■ สีน้ำเงิน

NH₃-N มาก → สีน้ำเงินเข้ม → ค่า absorbance สูง นำค่าที่วัดได้ไปเทียบกับ STD ที่รู้ความเข้มข้น (STD curve)

0A 0.003

1A 0.047

2A 0.092

4A 0.192

8A 0.392

16A 0.762

STD (mg/dL) และค่า absorbance ตัวอย่างจากเอกสาร — ยิ่งเข้มข้นยิ่งน้ำเงิน

ทำไมต้องรู้ค่า NH₃-N ในรูเมน

โปรตีนและ NPN (เช่น ยูเรีย) ในอาหารถูกจุลินทรีย์ย่อยได้ แอมโมเนีย
จุลินทรีย์ใช้แอมโมเนียร่วมกับพลังงานจากคาร์โบไฮเดรต สร้างโปรตีนจุลินทรีย์ ซึ่งเป็นแหล่งโปรตีนหลักของสัตว์เคี้ยวเอื้อง
ถ้า NH₃-N ต่ำเกินไป จุลินทรีย์โตไม่เต็มที่ การย่อยเยื่อใยลดลง
ถ้าสูงเกินไป ส่วนเกินถูกดูดซึมไปเปลี่ยนเป็นยูเรียที่ตับ แล้วขับทิ้งทางปัสสาวะ (สูญเสียไนโตรเจนและพลังงาน)

คิดตามถ้าเสริมยูเรียในอาหารแต่ให้แหล่งพลังงานที่หมักได้เร็ว (เช่น มันสำปะหลัง) ไม่พอ ค่า NH₃-N ในรูเมนจะเป็นอย่างไร เพราะอะไร?

ป้าย “ข้อเสนอเพิ่ม · ไม่บังคับ”กล่องเส้นประสีม่วงในคู่มือนี้เป็นคำแนะนำเสริมเท่านั้น วิธีหลักทดสอบแล้วว่าวิเคราะห์ได้ดี ทำตามขั้นตอนหลักได้เลย

ลำดับงานทั้งหมด

1เตรียมสารเคมี
ล่วงหน้า

2เตรียมตัวอย่าง
กรอง · เติมกรด · ปั่น

3ใส่หลอด
STD/ตัวอย่าง 40 µL

4Aเติมสาร
น้ำ → phenol → hypo

4Bบ่ม
37 °C 10 นาที มืด

5วัดค่า
630 nm

6คำนวณ
STD curve × 100/90

★วางแผนหลอดและปริมาณสาร

ใส่จำนวนตัวอย่างของกลุ่ม แล้วจะได้จำนวนหลอด ปริมาณสารที่ต้องเตรียม และผังหลอด (ใช้ผังนี้เขียนเลขข้างหลอด)

จำนวนตัวอย่างน้ำรูเมน

ซ้ำต่อตัวอย่าง

ซ้ำต่อระดับ STD

เผื่อสูญเสีย (%)

หลอดทั้งหมด–

Phenol color reagent–

Alkaline hypochlorite–

น้ำกลั่น (ขั้น 4.1)–

ผังหลอด

หลอด	ชื่อ	ใส่อะไร 40 µL	ใส่แล้ว

1เตรียมสารเคมี ล่วงหน้า · ผู้ช่วยสอน/อาจารย์

นักศึกษาอ่านเพื่อเข้าใจว่าแต่ละขวดบนโต๊ะทำมาอย่างไร (ส่วนใหญ่เตรียมไว้ก่อนวันแลป) · ทุกขวดติดฉลาก: ชื่อสาร · วันที่ · ผู้เตรียม

1.1

2 N HCl (ใช้ปรับ pH ของ Stock STD)

ตวง HCl 37 %wt/wt 16.58 mL ปรับปริมาตรด้วยน้ำกลั่นให้ครบ 100 mL

ระวังทำในตู้ดูดควัน · เติมกรดลงในน้ำ ห้ามเติมน้ำลงในกรด

พร้อมแล้ว

1.2

Stock STD 32 mg NH₃-N/100 mL

ชั่งแอมโมเนียมคลอไรด์ (NH₄Cl) 0.1222 g ใส่บีกเกอร์ 100 mL
เติมน้ำกลั่น 80 mL คนด้วย stirrer ที่อุณหภูมิห้องจนละลายหมด
หยด 2 N HCl จน pH = 2
เทลง volumetric flask 100 mL ล้างบีกเกอร์ด้วยน้ำกลั่นเล็กน้อยเทตามลงไป แล้วปรับปริมาตรให้ครบ 100 mL
เก็บในขวดแก้วปิดฝาสนิทที่ 2–10 °C ใช้ได้ไม่เกิน 6 เดือน

ทำไมต้อง pH 2ในสภาพกรด แอมโมเนียอยู่ในรูป NH₄⁺ ซึ่งไม่ระเหย ความเข้มข้นของ STD จึงคงที่ตลอดอายุการเก็บ

ที่มาของ 0.1222 gNH₄Cl 53.49 g/mol มี N 14.01 g/mol → 0.1222 g × (14.01/53.49) = 32.0 mg N ใน 100 mL (ฉบับเดิมชั่ง 0.1 g จะได้ NH₃-N 26.2 mg/100 mL)

พร้อมแล้ว

1.3

STD series 6 ระดับ (เจือจางทีละ 2 เท่า)

STD (mg/dL)	ดูดจาก	ปริมาตรที่ดูด	+ น้ำกลั่น
16	Stock 32 mg/dL	0.2 mL	0.2 mL
8	STD 16	0.2 mL	0.2 mL
4	STD 8	0.2 mL	0.2 mL
2	STD 4	0.2 mL	0.2 mL
1	STD 2	0.2 mL	0.2 mL
0	ใช้น้ำกลั่นขวดเดียวกับที่ใช้เจือจาง STD

ผสมให้เข้ากัน (vortex) ทุกครั้งก่อนดูดไปทำระดับถัดไป · เปลี่ยน tip ทุกครั้ง

ข้อเสนอเพิ่ม · ไม่บังคับถ้าต้องการ STD เหลือพอทำหลายซ้ำ หรืออยากลดความคลาดเคลื่อนสะสมจากการเจือจางทีละ 2 เท่า อาจทำครั้งละ 1.0 mL + น้ำกลั่น 1.0 mL ได้ ความเข้มข้นเท่าเดิม

พร้อมแล้ว

1.4

Alkaline hypochlorite reagent (1,000 mL)

ชั่ง NaOH (AR grade) 5 g ใส่บีกเกอร์ 1,000 mL เติมน้ำกลั่นประมาณ 650 mL
เติม Na₂HPO₄·7H₂O 37.85 g หรือ Na₂HPO₄ (แบบไม่มีน้ำผลึก) 20.05 g
คนด้วย stirrer และให้ความร้อนประมาณ 60 °C จนละลายหมด
ปิด heater ตั้งทิ้งให้เย็นถึงอุณหภูมิห้อง
เติม Sodium hypochlorite (NaOCl) 5.25 %wt/v 50 mL — ตวงแล้วเติมทันที ห้ามตวงทิ้งไว้หรือเทกลับขวด
เทลง volumetric flask 1,000 mL ล้างบีกเกอร์ตาม แล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ 1,000 mL คนให้เข้ากัน
กรองผ่านกระดาษกรอง Whatman #1 เก็บในขวดพลาสติกทึบแสง ที่ 2–10 °C ใช้ได้ไม่เกิน 6 เดือน

ต้องรอให้เย็นก่อนเติม NaOClhypochlorite สลายตัวเร็วเมื่อร้อน ถ้าเติมตอนร้อนจะเหลือ hypochlorite น้อย สีที่เกิดจะอ่อนลง

พร้อมแล้ว

1.5

Phenol color reagent (1,000 mL) ตู้ดูดควัน

Sodium nitroprusside (Na₂Fe(CN)₅NO·2H₂O) 0.05 g ในบีกเกอร์ 1,000 mL + น้ำกลั่น 500 mL คนจนละลาย
เทลง volumetric flask 1,000 mL ล้างบีกเกอร์ตาม
เติม Phenol (C₆H₅OH) 10 g แล้วเติมน้ำกลั่นให้ครบ 1,000 mL คนจนเข้ากัน
เก็บในขวดแก้วสีชา พ้นแสง ที่ 2–10 °C ใช้ได้ไม่เกิน 6 เดือน

Phenol เป็นพิษและกัดผิวหนังสวมถุงมือไนไตรล์และแว่นตา ถ้าโดนผิวให้ล้างน้ำปริมาณมากทันทีแล้วแจ้งอาจารย์

พร้อมแล้ว

สรุปการเก็บรักษา

สาร	ภาชนะ	อุณหภูมิ	อายุ
Stock STD 32 mg/dL	ขวดแก้วปิดสนิท	2–10 °C	≤ 6 เดือน
Alkaline hypochlorite	ขวดพลาสติกทึบแสง	2–10 °C	≤ 6 เดือน
Phenol color reagent	ขวดแก้วสีชา	2–10 °C	≤ 6 เดือน
ตัวอย่างน้ำรูเมน (เติมกรดแล้ว)	หลอดปิดฝา	−20 °C	จนกว่าจะวิเคราะห์

2เตรียมตัวอย่างน้ำรูเมน

ถ้าตัวอย่างถูกเตรียมและแช่แข็งไว้แล้ว ให้ข้ามไปขั้น 2.4 ได้เลย

2.1

กรองน้ำรูเมน

กรองผ่านผ้าขาวบาง 4 ชั้น เพื่อแยกเศษอาหารออก

ทำเสร็จแล้ว

2.2

เติมกรด 6 N HCl

น้ำรูเมน 0.9 mL + 6 N HCl 0.1 mL = รวม 1.0 mL

ทำไมต้องเติมกรด(1) หยุดกิจกรรมของจุลินทรีย์ ค่า NH₃-N จะได้ไม่เปลี่ยนหลังเก็บ (2) เปลี่ยน NH₃ เป็น NH₄⁺ ที่ไม่ระเหย

จำไว้ใช้ตอนคำนวณตัวอย่างถูกเจือจางด้วยกรด → ต้องคูณ 100/90 ในขั้นที่ 6

ทำเสร็จแล้ว

2.3

ปั่นเหวี่ยง

ปั่นที่ 12,000 × g นาน 20 นาที แล้วเก็บเฉพาะส่วนใส (supernatant)

ทำไมตะกอนและเซลล์จุลินทรีย์ทำให้สารละลายขุ่น แสงกระเจิง ค่า absorbance จะสูงเกินจริง

ทำเสร็จแล้ว

2.4

วิเคราะห์ทันที หรือแช่ −20 °C

ถ้าแช่แข็งไว้ วันแลปให้ละลายน้ำแข็งให้หมด แล้ว vortex ให้เข้ากันดีก่อนดูด

ข้อผิดพลาดที่พบบ่อยดูดตัวอย่างตอนยังละลายไม่หมดหรือไม่ได้ vortex → ความเข้มข้นในหลอดไม่เท่ากัน ค่าซ้ำต่างกันมาก

ทำเสร็จแล้ว

3ใส่ STD และตัวอย่างลงหลอด

ใช้ผังหลอดจากหัวข้อ “วางแผนหลอด” · auto pipette ขนาด 100 µL · เปลี่ยน tip ทุกครั้ง

3.1

เขียนเลขข้างหลอดตามผัง

เขียนบนข้างหลอดด้วยปากกาเคมี ไม่เขียนบนฝา (ฝาสลับกันได้)

ทำเสร็จแล้ว

3.2

STD: ใส่ระดับละ 40 µL ต่อหลอด

ใส่ STD 0 → 1 → 2 → 4 → 8 → 16 mg/dL ลงก้นหลอด (ไม่ป้ายข้างหลอด)

ทำเสร็จแล้ว

3.3

ตัวอย่างน้ำรูเมน: ใส่ 40 µL ต่อหลอด (1 หลอดต่อ 1 ซ้ำ)

vortex ตัวอย่างอีกครั้งก่อนดูดทุกครั้ง

เทคนิคการดูด 40 µLกดถึงจุดหยุดแรก → จุ่มปลาย tip ลงใต้ผิวของเหลวเล็กน้อย → ปล่อยช้า ๆ → เช็คว่าไม่มีฟองอากาศใน tip → ปล่อยลงก้นหลอดจนถึงจุดหยุดที่สอง

ทำเสร็จแล้ว

4เติมสาร ผสม และบ่ม

เติมสารตามลำดับนี้ให้ครบทุกหลอด ปริมาตรรวมต่อหลอด = 40 + 40 + 2,500 + 2,000 = 4,580 µL

ลำดับ	เติม	ปริมาตร	pipette
(ขั้น 3)	STD หรือ ตัวอย่าง	40 µL	100 µL
4.1	น้ำกลั่น	40 µL	100 µL
4.2	Phenol color reagent	2,500 µL	5,000 µL
4.3	Alkaline hypochlorite reagent	2,000 µL	5,000 µL

4.1

เติมน้ำกลั่น 40 µL ทุกหลอด

ทำเสร็จแล้ว

4.2

เติม Phenol color reagent 2,500 µL ทุกหลอด

ตั้ง auto pipette 5,000 µL ไว้ที่ 2,500 µL

ทำเสร็จแล้ว

4.3

เติม Alkaline hypochlorite reagent 2,000 µL ทุกหลอด

เปลี่ยน tip ก่อนเปลี่ยนชนิดสาร (อย่าใช้ tip ของ phenol มาดูด hypochlorite)

ทำให้เหมือนกันทุกหลอดเติมเรียงตามเลขหลอดและใช้ความเร็วใกล้เคียงกัน สีจะเริ่มเกิดตั้งแต่เติม hypochlorite ถ้าบางหลอดทิ้งไว้นานกว่าหลอดอื่นมาก สีจะไม่สม่ำเสมอ

ทำเสร็จแล้ว

4.4

ปิดฝาให้สนิท แล้ว Vortex

ทำเสร็จแล้ว

4.5

บ่มใน Water bath 37 °C นาน 10 นาที ไร้แสง

ปิดฝา water bath หรือคลุมด้วยฟอยล์ให้มืด · ครบเวลาจะได้สารผสมสีน้ำเงิน (STD ที่เข้มข้นมากจะน้ำเงินเข้มกว่า)

10:00 กดเริ่มเมื่อหลอดลง water bath ครบทุกหลอด

ทำเสร็จแล้ว

4.6

นำหลอดออกจาก Water bath

วัดค่าได้เลย สีที่เกิดอยู่ได้ไม่เกิน 24 ชั่วโมง

เช็คด้วยตาSTD 0 ควรเกือบใส และสีเข้มขึ้นตามลำดับ 1 → 16 ถ้าเรียงสีไม่ถูกหรือมีหลอดที่ไม่เกิดสีเลย ให้สงสัยว่าลืมเติมสารหรือเติมผิดหลอด

ทำเสร็จแล้ว

5วัดค่า Absorbance ที่ 630 nm

ใช้ cuvette อันเดียวตลอด วัดจาก STD เข้มข้นต่ำ → สูง แล้วจึงวัดตัวอย่าง

5.1

เปิดเครื่องและตั้งค่า

เปิด Spectrophotometer (Eppendorf BioSpectrometer) → เลือกฟังก์ชัน Absorbance → ตั้งความยาวคลื่น 630 nm (วิธีใช้เครื่องโดยละเอียดดูในคู่มือเครื่อง)

ทำไมต้อง 630 nmสารละลายสีน้ำเงินดูดกลืนแสงสีส้ม-แดงได้มาก Indophenol ดูดกลืนแสงได้สูงสุดในช่วงนี้ การวัดจึงไวที่สุด (630 nm เป็นแสงที่ตามองเห็น ไม่ใช่ UV)

ทำเสร็จแล้ว

5.2

ตั้ง Blank ด้วยน้ำกลั่น

ใส่น้ำกลั่นลง cuvette 300 µL → กดปุ่ม Blank
ใช้ auto pipette (ตั้ง 1,000 µL) ดูดน้ำกลั่นออกให้หมด

ระวังอย่าให้ปลาย tip ขูดผนัง cuvette รอยขีดข่วนทำให้แสงกระเจิงและค่าเพี้ยนตลอดไป · จับ cuvette ด้านที่ขุ่น ไม่จับด้านที่แสงผ่าน

ทำเสร็จแล้ว

5.3

วัดทีละหลอด ทำวนแบบนี้ทุกครั้ง

ใส่สารจากหลอด 300 µL→วัด + จดค่า→ดูดออกให้หมด→ล้างด้วยน้ำกลั่น 500 µL→ดูดออกให้หมด→หลอดถัดไป

เริ่มที่ STD 0 → 1 → 2 → 4 → 8 → 16 mg/dL
ต่อด้วยตัวอย่างตามเลขหลอด
จดค่าลงแบบฟอร์ม หรือกรอกในเครื่องคำนวณหัวข้อ 6 ได้เลย

ฟองอากาศถ้ามีฟองใน cuvette ให้เคาะเบา ๆ หรือดูดออกแล้วใส่ใหม่ ฟองทำให้ค่าสูงผิดปกติ

ข้อเสนอเพิ่ม · ไม่บังคับถ้าตัวอย่างมีค่า absorbance สูงกว่า STD 16 แสดงว่าอยู่นอกช่วงของ STD curve ให้เจือจางตัวอย่างด้วยน้ำกลั่น (เช่น 1:1) แล้วทำขั้น 3–5 ใหม่ จากนั้นใส่ตัวคูณเจือจางในเครื่องคำนวณ

วัดครบทุกหลอดแล้ว

5.4

เก็บ cuvette

ล้างด้วยน้ำกลั่น ห่อด้วยสำลี แล้วเก็บในถุงพลาสติกให้มิดชิด · ทิ้งสารในหลอดลงภาชนะของเสียเคมี (มี phenol) ห้ามเทลงอ่าง

ทำเสร็จแล้ว

6สร้าง STD curve และคำนวณ NH₃-N

สูตร

ขั้นที่ 1 · สร้าง STD curve (สมการเส้นตรงจาก STD 6 จุด)

Y = a + bX

Y	ความเข้มข้น NH₃-N (mg/dL = mg/100 mL = mg%)
X	ค่า absorbance ที่ 630 nm
a, b	ค่าตัดแกน และความชันของเส้นตรง

ขั้นที่ 2 · แทนค่า absorbance ของตัวอย่าง (ใช้ค่าเฉลี่ยของซ้ำ) ลงในสมการ

ขั้นที่ 3 · ปรับการเจือจางด้วยกรด (น้ำรูเมน 0.9 + HCl 0.1 mL)

NH₃-N (mg/dL) = Y × (100/90)

100 = ปริมาตรรวมหลังเติมกรด (น้ำรูเมน 90 ส่วน + กรด 10 ส่วน) · 90 = ส่วนที่เป็นน้ำรูเมน · แปลงหน่วย: mg/dL × 10 = mg/L

ตัวอย่างจากเอกสาร

STD curve: Y = 20.926X − 0.0231 (n = 6, R² = 0.9997)

ตัวอย่าง	Abs	Y = 20.926X − 0.0231	× 100/90
Sample1	0.457	9.54	10.60
Sample2	0.311	6.48	7.20
Sample3	0.100	2.07	2.30
Sample4	0.712	14.88	16.53

เช่น Sample1: (20.926 × 0.457) − 0.0231 = 9.54 → 9.54 × 100/90 = 10.60 mg/dL

ลืมบ่อยลืมลบค่าตัดแกน (a) หรือลืมคูณ 100/90

เครื่องคำนวณ — กรอกค่าที่วัดได้จริง

ค่าที่กรอกบันทึกไว้ในเครื่องนี้ ปิดหน้าแล้วกลับมาค่ายังอยู่

STD

STD	mg/dL (Y)	Abs 630 (X)

น้ำรูเมน (mL)

6 N HCl (mL)

สมการ STD curve–

R²–

ตัวอย่างน้ำรูเมน

ชื่อตัวอย่าง	Abs ซ้ำ 1	Abs ซ้ำ 2	เจือจางเพิ่ม (×)	Abs เฉลี่ย	Y (mg/dL)	NH₃-N (mg/dL)	mg/L	หมายเหตุ

ช่อง “เจือจางเพิ่ม” ใส่ 1 ถ้าไม่ได้เจือจาง (ใช้เฉพาะกรณีเจือจางตัวอย่างที่ค่าเกิน STD)

หมายเหตุ: เครื่องคำนวณใช้ค่า a, b แบบไม่ปัดเศษ ผลจึงอาจต่างจากการคิดมือด้วยสมการที่ปัดแล้วได้ ±0.01 (เช่น Sample2 ได้ 7.21 ส่วนในเอกสารได้ 7.20)

ข้อเสนอเพิ่ม · ไม่บังคับ — ช่วยแปลผล

< 5 mg/dL อาจต่ำจนจำกัดการสังเคราะห์โปรตีนจุลินทรีย์ (Satter & Slyter, 1974)
15–30 mg/dL ช่วงที่ Wanapat & Pimpa (1999) รายงานว่าเหมาะสมในกระบือปลักที่ได้รับฟางข้าว
ค่าขึ้นกับชนิดอาหารและเวลาที่เก็บตัวอย่างหลังให้อาหาร — ใช้เปรียบเทียบระหว่างทรีตเมนต์ในการทดลองเดียวกัน

!ความปลอดภัยและข้อผิดพลาดที่พบบ่อย

Safety checklist

สวมถุงมือ แว่นนิรภัย lab coat ตลอดเวลา
Phenol color reagent เป็นพิษ — ระวังหก ถ้าโดนผิวล้างน้ำมาก ๆ ทันที
Alkaline hypochlorite เป็นด่างและมีคลอรีน — ห้ามผสมกับกรด (HCl) โดยตรง เพราะเกิดก๊าซคลอรีน
6 N HCl กัดกร่อน — ใช้ในตู้ดูดควัน
น้ำรูเมนมีจุลินทรีย์ — ล้างมือหลังสัมผัสทุกครั้ง
ของเสียจากหลอดทิ้งลงภาชนะของเสียเคมี ห้ามเทลงอ่าง

ข้อผิดพลาด	ผลที่เกิด	วิธีป้องกัน
ไม่ vortex ตัวอย่างหลังละลายน้ำแข็ง	ค่าซ้ำต่างกันมาก	ละลายให้หมด + vortex ก่อนดูดทุกครั้ง
ใช้ tip ซ้ำข้ามหลอด/ข้ามสาร	ปนเปื้อน ค่าเพี้ยน	เปลี่ยน tip ทุกครั้ง
ไม่ปิดฝาก่อน vortex / ไม่ vortex	หก หรือสีไม่สม่ำเสมอ	ปิดฝาสนิทแล้ว vortex ทุกหลอด
บ่มไม่ครบ 10 นาที / โดนแสง	สีไม่สมบูรณ์ ค่าต่ำ	ใช้ timer · ปิดฝา water bath ให้มืด
ไม่ล้าง cuvette ระหว่างหลอด	สีจากหลอดก่อนหน้าค้าง ค่าสูงเกิน	ล้างน้ำกลั่น 500 µL ทุกครั้ง
มีฟองหรือรอยขีดข่วนใน cuvette	แสงกระเจิง ค่าสูงผิดปกติ	เคาะไล่ฟอง · ระวังปลาย tip
ลืมลบค่าตัดแกน หรือลืมคูณ 100/90	ผลคำนวณผิด	ใช้เครื่องคำนวณในหัวข้อ 6 ตรวจซ้ำ

📝แบบฟอร์มบันทึกผล

พิมพ์หน้านี้ไปใช้ที่โต๊ะแลป · ผังหลอดอัปเดตตามจำนวนที่ใส่ในหัวข้อ “วางแผนหลอด”

วันที่: ______________

กลุ่ม: ______________

ผู้วิเคราะห์: ______________

ความยาวคลื่น: 630 nm

เวลาเริ่มบ่ม: ______________

เวลาวัด: ______________

หลอด	ชื่อ	mg/dL (STD)	Abs 630 nm	หมายเหตุ

STD curve: Y = ________ + ________ X R² = ________
ตัวอย่าง ________: Y = ________ mg/dL × 100/90 = ________ mg/dL = ________ mg/L

0ภาพรวมและหลักการ

หลักการ: Berthelot reaction

ทำไมต้องรู้ค่า NH3-N ในรูเมน

ลำดับงานทั้งหมด

★วางแผนหลอดและปริมาณสาร

ผังหลอด

✓อุปกรณ์และสารเคมี (เช็กก่อนเริ่ม)

อุปกรณ์

สารที่ต้องมีบนโต๊ะ

1เตรียมสารเคมี ล่วงหน้า · ผู้ช่วยสอน/อาจารย์

2 N HCl (ใช้ปรับ pH ของ Stock STD)

Stock STD 32 mg NH3-N/100 mL

STD series 6 ระดับ (เจือจางทีละ 2 เท่า)

Alkaline hypochlorite reagent (1,000 mL)

Phenol color reagent (1,000 mL) ตู้ดูดควัน

สรุปการเก็บรักษา

2เตรียมตัวอย่างน้ำรูเมน

กรองน้ำรูเมน

เติมกรด 6 N HCl

ปั่นเหวี่ยง

วิเคราะห์ทันที หรือแช่ −20 °C

3ใส่ STD และตัวอย่างลงหลอด

เขียนเลขข้างหลอดตามผัง

STD: ใส่ระดับละ 40 µL ต่อหลอด

ตัวอย่างน้ำรูเมน: ใส่ 40 µL ต่อหลอด (1 หลอดต่อ 1 ซ้ำ)

4เติมสาร ผสม และบ่ม

เติมน้ำกลั่น 40 µL ทุกหลอด

เติม Phenol color reagent 2,500 µL ทุกหลอด

เติม Alkaline hypochlorite reagent 2,000 µL ทุกหลอด

ปิดฝาให้สนิท แล้ว Vortex

บ่มใน Water bath 37 °C นาน 10 นาที ไร้แสง

นำหลอดออกจาก Water bath

5วัดค่า Absorbance ที่ 630 nm

เปิดเครื่องและตั้งค่า

ตั้ง Blank ด้วยน้ำกลั่น

วัดทีละหลอด ทำวนแบบนี้ทุกครั้ง

เก็บ cuvette

6สร้าง STD curve และคำนวณ NH3-N

สูตร

ตัวอย่างจากเอกสาร

เครื่องคำนวณ — กรอกค่าที่วัดได้จริง

ตัวอย่างน้ำรูเมน

!ความปลอดภัยและข้อผิดพลาดที่พบบ่อย

Safety checklist

📝แบบฟอร์มบันทึกผล

ทำไมต้องรู้ค่า NH₃-N ในรูเมน

Stock STD 32 mg NH₃-N/100 mL

6สร้าง STD curve และคำนวณ NH₃-N